وکتورها در ژن‌درمانی

ژن درمانی، که طی آن DNA مورد نظر به داخل سلول‌های هدف انتقال می‌یابد، با روش‌های متعددی اجرا می‌شود که در ادامه خلاصه ای از این روش‌ها آورده شده‌است. دو گروه اصلی از روش‌های ژن درمانی روش‌های مبتنی بر استفاده از ویروس‌های نوترکیب (که گهگاهی نانوذرات زیستی یا وکتورهای ویروسی نامیده می‌شوند) و روش‌های غیرویروسی که از DNA برهنه یا کمپلکس DNA استفاده می‌کنند، می‌باشند.

ویروس‌ها

تمامی ویروس‌ها با الحاق به سلول میزبان و انتقال مواد ژنتیکی سیکل همانندسازی خود را داخل سلول میزبان کامل می‌کنند. این مواد ژنتیکی «دستورالعمل‌های» پایه ای نحوهٔ تولید نسخه‌های زیادی از ویروس‌ها را به ژنوم میزبان انتقال داده و باعث می‌شود دستگاه همانندسازی سلول میزبان در راستای تأمین نیازهای ویروس فعالیت نماید. در نتیجه سلول میزبان نسخه‌های فراوانی از ویروس‌ها را که منجر به آلوده شدن سلول‌های بیشتری می‌شوند را تولید و حمل می‌کند. برخی از ویروس‌ها ژنوم خود را وارد سیتوپلاسم میزبان کرده اما به‌طور واقعی داخل سلول میزبان نمی‌شوند اما برخی دیگر از ویروس‌ها به غشای سلولی نفوذ کرده و به مولکول‌های پروتئینی مبدل و داخل سلول می‌شوند.

عفونت‌های ویروسی شامل دو نوع چرخه لیتیک و لیزوژنیک می‌باشند. در چرخه لیتیک، ویروس پس از جای دادن DNA خود درون سلول میزبان به سرعت تولید ویروس‌های بیشتری کرده و در نتیجه سلول‌های بیشتری را آلوده می‌کند. ویروس‌هایی که وارد چرخه لیزوژنیک می‌شوند، DNA خود را درون DNA سلول میزبان ادغام کرده و ممکن است بتوانند سال‌ها در بدن میزبان زندگی کنند. این ویروس‌ها بدون تحریک قادرند خود را بدون تحمیل آسیب به سلول بازتولید کنند. تحریک، DNA ویروس را از ژنوم میزبان آزاد و برای ایجاد ویروس‌های جدید بکار می‌رود. ویروس‌ها انواع مختلفی داشته که هر کدام می‌توانند برای اهداف خاص به عنوان وکتور در ژن درمانی استفاده شوند. در ادامه خلاصه ای از برخی ویروس‌ها که به عنوان وکتور هم مورد استفاده قرار می‌گیرند، آورده می‌شود.

رتروویروس‌ها

مواد ژنتیکی در رتروویروس‌ها از جنس مولکول‌های RNA بوده در حالیکه مواد ژنتیکی سلول میزبان از جنس DNA می‌باشد. زمانی که رترویروس یک سلول میزبان را آلوده می‌کند، RNA خود را به همراه برخی از آنزیم‌ها از جمله ترانس کریپتاز معکوس و اینتگراز، وارد سلول میزبان می‌کند. مولکول‌های RNA رتروویروس‌ها قبل از ادغام با ژنوم میزبان بایستی به DNA تبدیل شوند. فرایند تولید نسخه DNA از مولکول RNA ترانس کریپتاز معکوس نامیده می‌شود. پس از اینکه یک نسخه از DNA تولید و در هسته سلول میزبان رها شد باید داخل ژنوم سلول میزبان ادغام شود. این فرایند به وسیلهٔ دیگر آنزیم‌های حمل شده در رترویروس که اینتگراز نامیده می‌شوند انجام می‌گردد.

حال که مواد ژنتیکی ویروس جای داده شد می‌توان گفت که سلول میزبان با ژن‌های جدید تغییریافته‌است؛ و چنانچه بعدها سلول میزبان تقسیم شود زاده‌های آن حاوی ژن‌های جدید خواهند شد.

آدنوویروس‌ها

آدنوویروس‌ها ویروس‌هایی هستند که مواد ژنتیکی شان را در شکل DNA دو رشته‌ای حمل می‌کنند. این ویروس‌ها سبب عفونت‌هایی همچون عفونت‌های تنفسی، روده ای و چشمی در انسان می‌شوند. زمانی که این ویروس‌ها یک سلول میزبان را آلوده می‌کنند مولکول‌های DNA خود را به میزبان معرفی می‌کنند اما مواد ژنتیکی آدنوویروس در مواد ژنتیکی سلول میزبان ادغام نمی‌شود بلکه مولکول DNA داخل هسته سلول میزبان رها شده و ساختارهای DNA خارجی درست مانند هر ژن دیگر رونویسی می‌شوند. تنها تفاوت آدنوویروس‌ها در این است که هنگام تقسیم سلول میزبان، ژن‌های خارجی همانندسازی نکرده در نتیجه سلول‌های حاصل از تقسیم سلولی ژن اضافی نخواهند داشت. در نتیجه درمان یک جمعیت سلولی در حال رشد با آدنوویروس‌ها نیازمند تزریق مجدد آن‌ها می‌باشد.

ویروس هِرپِس سیمپلکس (HSV-1)

ویروس هرپس سیمپلکس یک ویروس نوروتروپیک انسانی است که عمدتاً برای انتقال ژن در سیستم عصبی استفاده می‌شود. ویروس HSV-1 نوع وحشی از ویروس می‌باشد که قادر به آلوده سازی نورون‌ها و فرار از پاسخ ایمنی میزبان می‌باشد اما ممکن است این ویروس غیرفعال شده و تولید یک چرخه لیتیک از همانندسازی ویروسی کند بنابراین معمولاً از سویه موتانت HSV-1 که در توانایی همانندسازی ناقص است استفاده می‌شود.

روش‌های غیرویروسی

روش‌های غیرویروسی در مقایسه با روش‌های ویروسی دارای مزایای خاصی از جمله امکان تولید در مقیاس بالا و ایمنی ژنتیکی پایین میزبان می‌باشند. سطوح پایین انتقال و بیان ژن از نقاط ضعف روش‌های غیرویروسی بوده‌اند که با پیشرفت‌های اخیر در فناوری وکتور باعث افزایش عملکرد مولکول‌ها شده و کارایی روش‌های غیر ویروسی به سطح روش‌های انتقال مبتنی بر وکتورهای ویروسی شده‌است.

تزریق DNA برهنه

تزریق DNA برهنه روشی ساده برای انتقال DNA به صورت غیرویروسی است. آزمایشات بالینی اجرا شده در زمینه تزریق درون عضلانی پلاسمیدهای حاوی DNA برهنه با چندین بحث روبرو است؛ در این روش در مقایسه با سایر روش‌ها میزان بیان کم است. علاوه بر آزمایشات انجام شده با پلاسمیدها، آزمایش‌هایی با محصولات PCR برهنه نیز انجام شده‌است. جذب سلولی DNA برهنه به‌طور کلی ناکارآمد است از این رو محققان روی بهبود کارایی جذب DNA تمرکز کرده‌اند که باعث ایجاد روش‌های جدیدی شده‌است از جمله این روش‌ها می‌توان به الکتروپوریشن، سونوپوریشن و استفاده از «تفنگ ژن» که با استفاده از فشار بالای گاز DNA پوشش داده شده با ذرات طلا را به سلول پرتاب می‌کند، اشاره کرد.

روش‌هایی فیزیکی جهت بهبود انتقال DNA

الکتروپوریشن

الکتروپوریشن روشی است که از پالس‌های کوتاهی از ولتاژ بالا برای حمل DNA در امتداد غشای سلولی استفاده می‌کند. تصور می‌شود که این شوک سبب شکل‌گیری موقت منافذ در غشای سلولی شده و این منافذ موجب انتقال مولکول DNA می‌گردد.

تفنگ ژنی

استفاده از بمباران ذرات یا تفنگ ژنی روش فیزیکی دیگری برای انتقال DNA می‌باشد. در این فناوری DNA بر روی ذرات طلا پوشیده شده و درون یک وسیله ای که به منظور دست یابی به نفوذ DNA تولید نیرو می‌کند، بارگذاری می‌شوند.

سونوپوریشن

سونوپوریشن از فرکانس‌های اولتراسونیک برای ورود DNA به داخل سلول‌ها استفاده می‌کند. تصور می‌شود که فرایند حفره سازی صوتی غشای سلولی را تخریب کرده و بدین طریق منجر به حرکت DNA به داخل سلول می‌شود.

Magnetofection

در این روش DNA با ذرات مغناطیسی ترکیب شده و یک آهن‌ربا در زیر دیسک کشت بافت برای رساندن این ترکیب حاوی DNA در تماس با یک لایه سلولی قرار می‌گیرد.

انتقال هیدرودینامیکی

انتقال هیدرودینامیکی شامل تزریق حجم بالایی از محلولی هیدرودینامیکی به عروقی مانند ورید اجوف تحتانی، مجرای صفراوی می‌باشد. این محلول حاوی مولکول‌هایی مانند DNA یا siRNA است که به داخل سلول‌ها هدایت می‌شوند. انتقال این مولکول‌ها به داخل سلول به وسیلهٔ فشار هیدرواستاتیک بالای ایجاد شده از طریق حجم بالای محلول تزریق شده انجام می‌شود.

روش‌هایی شیمیایی جهت بهبود انتقال DNA

اولیگونوکلئوتیدها

استفاده از اولیگونوکلئوتیدهای سنتزی در ژن درمانی به منظور غیرفعالسازی ژن‌های درگیر در ایجاد بیماری به چندین روش استفاده می‌شوند. یکی از استراتژی‌های این روش، استفاده از قطعات آنتی سنس علیه ژن بیماری‌زا به منظور تخریب رونویسی آن می‌باشد. در استراتژی دیگر از مولکول‌های کوچک RNA، که siRNA نامیده می‌شوند، برای علامت دادن به سلول جهت شکستن mRNA ژن بیماری‌زا در توالی‌هایی خاص می‌باشد، این شکست تخریب‌کننده فرایند ترجمه mRNA بوده در نتیجه بیان ژن بیماری‌زا دچار اختلال می‌شود. در استراتژی دیگر از اولیگونوکلئوتیدهایی دورشته ای به عنوان طعمه ای برای فاکتورهای رونویسی مورد نیاز برای رونویسی ژن هدف استفاده می‌کند. فاکتورهای رونویسی به تله‌های پروموتر (Promoter) ژن معیوب متصل و رونویسی از ژن هدف که باعث بروز بیماری می‌شود را کاهش می‌دهند.

لیپوپلکس‌ها

یکی از لازمه‌های بهبود انتقال DNA جدید به داخل سلول، حفاظت DNA از صدمات و (بار مثبت) می‌باشد. بدین منظور در ابتدا، از چربی‌های آنیونی و خنثی برای ساخت لیپوپلکس‌هایی با نقش وکتورهای مصنوعی استفاده می‌شدند. علی‌رغم سمیت کم و سازگاری بالای این ترکیبات با مایعات بدن، تولید آن‌ها پیچیده و وقت گیر بوده و توجهات به سمت تولید نسخه‌های کاتیونی پیش رفت.

با توجه به بار مثبت لیپیدهای کاتیونی، از آن‌ها اولین بار به منظور متراکم سازی مولکول‌های DNA و برای تسهیل سازی کپسوله کردن آن‌ها داخل لیپوزوم‌ها استفاده شد. اندکی بعد مشخص شد که استفاده از لیپیدهای کاتیونی به‌طور معناداری پایداری لیپوپلکس‌ها را ارتقا می‌دهد همچنین با توجه به بار مثبت آن‌ها لیپوزوم‌های کاتیونی با غشای سلولی تعامل می‌کنند. اعتقاد است که اندوسیتوز به‌طور گسترده‌ای روش اصلی جذب لیپوپلکس‌ها توسط سلول است. متداولترین استفاده از لیپوپلکس‌ها در انتقال ژن به داخل سلول‌های سرطانی می‌باشد.

پلیمرزوم‌ها

پلیمرزوم‌ها انواع سنتزی لیپوزوم‌های (حاملینی با یک لایه لیپیدی) ساخته شده از کوپلیمرهای آبدوست هستند که می‌توانند هم محتوای آبدوست و هم آبگریز را کپسوله و برای تحویل بارهایی مانند DNA، پروتئین و داروها به سلول‌ها استفاده شوند. مزیت آن‌ها نسبت به لیپوزوم‌ها پایداری بالاتر، مقاومت مکانیکی و زمان گردش خون بالاتر و ظرفیت ذخیره بیشتر است.

پلی پلکس‌ها

ترکیب DNA با پلیمرها، پلی پلکس نامیده می‌شود. اکثر پلی پلکس‌ها شامل پلیمرهای کاتیونی بوده که ساخت آن‌ها بر اساس خودگردهمایی ناشی از اینترکشن‌های پلی پلکس‌ها انجام می‌شود.

دندریمرها

یک دندریمر مولکولی پرشاخه با ساختاری کروی است که سطح ذرات آن ممکن است با استفاده از روش‌های متعددی عامل دار شود. بسیاری از خواص ساختاری دندریمرها به وسیلهٔ سطح آن‌ها تعیین می‌شود. در حضور مواد ژنتیکی مانند DNA و RNA امکان ارتباط میان اسیدهای نوکلئیک دارای بار منفی با دندریمرهای کاتیونی وجود دارد.

نانوذرات غیرآلی

نشان داده شده که نانو ذرات غیرآلی مانند طلا، سیلیکا، اکسیدآهن و کلسیم فسفات قادر به انتقال ژن هستند. از مزایای این مواد می‌توان به پایداری ذخیره ای، هزینه تولید کم و اغلب ایمنوژنیستی کمتر و مقاومت در برابر حملات میکروبی اشاره نمود.

پپتیدهای نفوذکننده به سلول

پپتیدهای نفوذکننده به سلول، پپتیدهای کوتاهی (۴۰˂ آمینواسید) هستند که به‌طور کارایی، در حالیکه به صورت کوالانسی یا غیرکوالانسی به مولکول‌های متنوعی متصل می‌باشند از غشای سلولی عبور می‌کنند بنابراین قادر به تنظیم ورود مولکول‌هایی همچون اسیدهای نوکلئیک، لیپوزوم‌ها و داروهایی با وزن مولکولی کم به داخل سلول‌ها هستند.

روش‌های ترکیبی (هیبریدی)

از آنجا که هر کدام از روش‌های انتقال ژن دارای نواقص و معایبی می‌باشند چندین روش ترکیبی نیز ایجاد شده‌است. وایروزوم‌ها که از ترکیب لیپوزوم‌ها با ویروس‌های غیرفعال شده آنفلونزا یا HIV ایجاد می‌شوند نمونه ای از وکتورهای ترکیبی می‌باشند. در روش‌های ترکیبی کارایی انتقال ژن افزایش می‌یابد.

منابع

↑ 1. Durai S, Mani M, Kandavelou K, Wu J, Porteus MH, Chandrasegaran S (2005). "Zinc finger nucleases: custom-designed molecular scissors for genome engineering of plant and mammalian cells". Nucleic Acids Res. 33 (18): 5978–90. doi:10.1093/nar/gki912. PMC 1270952. PMID 16251401.
↑ 2. Harwood, Adrian J. Protocols for Gene Analysis. 1st. 31. Totowa, New Jersey: Humana Press, 1994. Print.
↑ 3. Murakami T and Sunada Y. Plasmid DNA Gene Therapy by Electroporation: Principles and Recent Advances. Curr Gene Ther. 2011 Oct 21;11(6).
↑ 4. Jump up^ Scribd.com
↑ 5. Jump up^ Bonamassa, B. , Hai, L. , & Liu, D. (2011). "Hydrodynamic gene delivery and its applications in pharmaceutical research.". Pharmaceutical Research. 28 (4): 694–701. doi:10.1007/s11095-010-0338-9.
↑ 6. Jump up^ Suda, T. , & Liu, D. (2007). "Hydrodynamic gene delivery: Its principles and applications.". Molecular Therapy. 15 (12): 2063–2069. doi:10.1038/sj.mt.6300314.
↑ 7. Jump up^ Al-Dosari, M. S. , Knapp, J. E. , & Liu, D. (2005). "Hydrodynamic delivery.". Advances in Genetics. 54: 65–82. doi:10.1016/S0065-2660(05)54004-5.
↑ 8. Krishnamoorthy, B. , Karanam, V. , Chellan, V. R. , Siram, K. , Natarajan, T. S. , & Gregory, M. (2014). "Polymersomes as an effective drug delivery system for glioma – a review.". Journal of Drug Targeting. 22 (6): 469–477. doi:10.3109/1061186X.2014.916712. PMID 24830300.
↑ 9. Jump up^ Chandrawati, R. , & Caruso, F. (2012). "Biomimetic liposome- and polymersome-based multicompartmentalized assemblies.". Langmuir. 28 (39): 13798–13807. doi:10.1021/la301958v. PMID 22831559.
↑ 10. Jump up^ Yin, H. , Kanasty, R. L. , Eltoukhy, A. A. , Vegas, A. J. , Dorkin, J. R. , & Anderson, D. G. (2014). "Non-viral vectors for gene-based therapy.". Nature Reviews Genetics. 15 (8): 541–555. doi:10.1038/nrg3763. PMID 25022906. horizontal tab character in |author= at position 9 (help)
↑ 11. Akinc A. ; Thomas M. ; Klibanov A. M. ; Langer R. (2005). "Exploring polyethylenimine-mediated DNA transfection and the proton sponge hypothesis". The Journal of Gene Medicine. 7 (5): 657–63. doi:10.1002/jgm.696. PMID 15543529.
↑ 12. Akinc A. ; Thomas M. ; Klibanov A. M. ; Langer R. (2005). "Exploring polyethylenimine-mediated DNA transfection and the proton sponge hypothesis". The Journal of Gene Medicine. 7 (5): 657–63. doi:10.1002/jgm.696. PMID 15543529.
↑ 13. Copolovici, D. M. , Langel, K. , Eriste, E. , & Langel, Ü. (2014). "Cell-penetrating peptides: Design, synthesis, and applications.". ACS Nano. 8 (3): 1972–1994. doi:10.1021/nn4057269. PMID 24559246.
↑ 14. Jump up^ Palm-Apergi1, C. , Lönn, P. , & Dowdy, S. F. (2012). "Do cell-penetrating peptides actually "penetrate" cellular membranes?". Molecular Therapy. 20 (4): 695–697. doi:10.1038/mt.2012.40.

[1] 1. Durai S, Mani M, Kandavelou K, Wu J, Porteus MH, Chandrasegaran S (2005). "Zinc finger nucleases: custom-designed molecular scissors for genome engineering of plant and mammalian cells". Nucleic Acids Res. 33 (18): 5978–90. doi:10.1093/nar/gki912. PMC 1270952. PMID 16251401.

[2] 2. Harwood, Adrian J. Protocols for Gene Analysis. 1st. 31. Totowa, New Jersey: Humana Press, 1994. Print.

[3] 3. Murakami T and Sunada Y. Plasmid DNA Gene Therapy by Electroporation: Principles and Recent Advances. Curr Gene Ther. 2011 Oct 21;11(6).

[4] 4. Jump up^ Scribd.com

[5] 5. Jump up^ Bonamassa, B. , Hai, L. , & Liu, D. (2011). "Hydrodynamic gene delivery and its applications in pharmaceutical research.". Pharmaceutical Research. 28 (4): 694–701. doi:10.1007/s11095-010-0338-9.

[6] 6. Jump up^ Suda, T. , & Liu, D. (2007). "Hydrodynamic gene delivery: Its principles and applications.". Molecular Therapy. 15 (12): 2063–2069. doi:10.1038/sj.mt.6300314.

[7] 7. Jump up^ Al-Dosari, M. S. , Knapp, J. E. , & Liu, D. (2005). "Hydrodynamic delivery.". Advances in Genetics. 54: 65–82. doi:10.1016/S0065-2660(05)54004-5.

[8] 8. Krishnamoorthy, B. , Karanam, V. , Chellan, V. R. , Siram, K. , Natarajan, T. S. , & Gregory, M. (2014). "Polymersomes as an effective drug delivery system for glioma – a review.". Journal of Drug Targeting. 22 (6): 469–477. doi:10.3109/1061186X.2014.916712. PMID 24830300.

[9] 9. Jump up^ Chandrawati, R. , & Caruso, F. (2012). "Biomimetic liposome- and polymersome-based multicompartmentalized assemblies.". Langmuir. 28 (39): 13798–13807. doi:10.1021/la301958v. PMID 22831559.

[10] 10. Jump up^ Yin, H. , Kanasty, R. L. , Eltoukhy, A. A. , Vegas, A. J. , Dorkin, J. R. , & Anderson, D. G. (2014). "Non-viral vectors for gene-based therapy.". Nature Reviews Genetics. 15 (8): 541–555. doi:10.1038/nrg3763. PMID 25022906. horizontal tab character in |author= at position 9 (help)

[11] 11. Akinc A. ; Thomas M. ; Klibanov A. M. ; Langer R. (2005). "Exploring polyethylenimine-mediated DNA transfection and the proton sponge hypothesis". The Journal of Gene Medicine. 7 (5): 657–63. doi:10.1002/jgm.696. PMID 15543529.

[12] 12. Akinc A. ; Thomas M. ; Klibanov A. M. ; Langer R. (2005). "Exploring polyethylenimine-mediated DNA transfection and the proton sponge hypothesis". The Journal of Gene Medicine. 7 (5): 657–63. doi:10.1002/jgm.696. PMID 15543529.

[13] 13. Copolovici, D. M. , Langel, K. , Eriste, E. , & Langel, Ü. (2014). "Cell-penetrating peptides: Design, synthesis, and applications.". ACS Nano. 8 (3): 1972–1994. doi:10.1021/nn4057269. PMID 24559246.

[14] 14. Jump up^ Palm-Apergi1, C. , Lönn, P. , & Dowdy, S. F. (2012). "Do cell-penetrating peptides actually "penetrate" cellular membranes?". Molecular Therapy. 20 (4): 695–697. doi:10.1038/mt.2012.40.